文章来源：red red sea Super Lab

qPCR实验中，引物设计是非常重要的一个环节，引物的合适与否与扩增效率是否达标、扩增产物是否特异、实验结果是否可用等息息相关。

您是不是在qPCR引物设计中感到困惑：如何使引物特异性最佳？有没有什么一劳永逸的方法？在设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：

• 引物尽量要跨内含子设计

• 产物长度100-300 bp

• TM值尽量接近60℃且上下游引物尽量接近

• 引物末端最好是G或C

第一步：查询基因

通过NCBI查询Homo GAS6的基因，这里要注意对比基因名称、种属，确保都要一致。

第二步：找到基因序列

1.若目标序列为基因组DNA，则选择第一个，为该基因的基因组DNA序列。若目标序列为mRNA，则选择第二个。

2.进入后，点击如下表的“CDS”，棕色背景序列即为该基因的编码序列。

第三步：设计引物

1.进入Primer-BLAST界面。

2.在左上方输入基因序列号或Fasta格式的序列，填写好相关参数。

3.点击“Get primers”NCBI就会弹出来告诉你，这样的参数选择会扩增到其他剪切变体，我们勾选不同的剪切变体并提交，就可以获得合适的引物对了！（如下图）

这些引物对的退火温度，都在60℃左右。根据实验目的，选择长度适中、特异性好和引物自身互补较少的引物进行实验，成功率还是相当高的呢！
 

第四步：引物特异性验证

Primer-Blast除了可以设计引物外，还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面，输入我们设计好的上下游引物，其它参数不调整，提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在啦，如果全部都显示在我们想要扩增的基因中，说明这对引物的特异性棒棒哒！(举例引物查询结果只此一条噢！）

第五步：引物质量判断

怎么样的引物才是集“扩增效率达标”、“扩增产物特性好”、“实验结果可靠”于一身呢。

引物的扩增效率达到90%-110%即认为扩增效率较好，熔解曲线单峰且通常Tm>80℃即认为扩增特异性较好。相当简单有木有啊～是不是感觉自己已经告别科研小白的身份，瞬间掌握了qPCR引物设计的绝招啦。